Προσδιορισμός φύλου σπερματοζωαρίων κάπρου

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ταυτοποίηση της μεθόδου για τον προσδιορισμό του φύλου των σπερματοζωαρίων του κάπρου με τη βοήθεια του κυτταρομετρητή ροής υψηλής ταχύτητας. Για τις ανάγκες της εργασίας χρησιμοποιήθηκαν 2 κάπροι φυλής Large White υψηλής γενετικής αξίας. Μια φορά την εβδομάδα γινόταν συλλογή του κλάσματος του εκσπερματίσματος που είναι πλούσιο σε σπερματοζωάρια με τη μέθοδο του «γαντιού». Για τη διαδικασία του προσδιορισμού του φύλου χρησιμοποιούνταν εκσπερματίσματα που έφεραν μαζική προοδευτική κίνηση >80%, ζωτικότητα >85% και συνολικό αριθμό σπερματο-ζωαρίων ανά εκσπερμάτισμα >20x109. Για τον προσδιορισμό της πυκνότητας του σπέρματος του κάπρου 50 μL από το δείγμα του σπέρματος αραιώνονταν με 5 ml του ειδικού αντιδραστηρίου και τοποθετούνταν στον ειδικό μετρητή του αριθμού των σπερματοζωαρίων τύπου SP-100. Στη συνέχεια το εκσπερμάτισμα που πληρούσε τα παραπάνω χαρακτηριστικά αραιώνονταν (1:1) με το αραιωτικό Beltsville Thawing Solution (BTS) ώστε να έχει πυκνότητα 1x106 σπερματοζωάρια/ml. Για τον προσδιορισμό της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων χρησιμοποιήθηκε αναλυτής σπέρματος υποβοηθούμενος από Η/Υ (CASA). Για τον προσδιορισμό της ζωτικότητας του σπέρματος χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρητής ροής συνοδευόμενος από Η/Υ. Τα αποτελέσματα εμφανίζονταν με την μορφή ιστογράμματος στα όποια με πράσινο χρώμα εμφανίζονταν τα ζωντανά σπερματοζωάρια και με κόκκινο τα νεκρά. Στη συνέχεια το υπόλοιπο σπέρμα αραιώνονταν με το αραιωτικό Beltsville Thawing Solution (BTS), μέχρις η τελική πυκνότητα να είναι 100x106 σπερματοζωάρια/ml. Κλάσμα 1 ml του αραιωμένου σπέρματος στη συνέχεια μεταφέρονταν σε πλαστικά κυλινδρικά σωληνάρια (Falcon) και γινόταν προσθήκη 5 μl μητρικού διαλύματος της φθορίζουσης χρωστικής ουσίας Hoechst 33342 (5 mg/ml). Ακολουθούσε επώαση σε σκοτεινό χώρο (υδατόλουτρο) στους 35°C για 50 λεπτά της ώρας. Πριν ξεκινήσει η διαδικασία του διαχωρισμού σε κάθε δείγμα γινόταν προσθήκη 1 μl χρωστικής τροφίμων από το μητρικό διάλυμα (25 mg/ml). Για το διαχωρισμό των σπερματοζωαρίων χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρητής ροής υψηλής ταχύτητας ο οποίος συνοδευόταν από λέιζερ αργού και λειτουργούσε με υπεριώδεις αχτίνες (μήκος κύματος 351-364 nm) στα 175 mW. Το φθορίζον χρώμα, που εξέπεμπαν τα σπερματοζωάρια, προσλαμβάνονταν από δυο ανιχνευτές, οι οποίοι ανέλυαν τη εκπομπή του φωτός και ξεχώριζαν τα θηλυκά από τα αρσενικά σπερματοζωάρια. Ακολουθούσε ο διαχωρισμός τους και ανάλογα με το φύλο φορτίζονταν με ηλεκτρικό φορτίο. Τα μεν θηλυκά φορτίζονταν με θετικό φορτίο, ενώ τα αρσενικά με αρνητικό φορτίο. Στην έξοδο ο κυτταρομετρητής φέρει δυο μαγνητικές πλάκες φορτισμένες η μία θετικά και η άλλη αρνητικά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα θηλυκά σπερματοζωάρια που φέρουν θετικό φορτίο να έλκονται από την αρνητικά φορτισμένη πλάκα και να οδηγούνται στο πλαστικό σωληνάριο που περιέχει τα θηλυκά σπερματοζωάρια. Αντίστοιχα, τα αρσενικά σπερματοζωάρια που φέρουν αρνητικό φορτίο να έλκονται από τη θετικά φορτισμένη πλάκα και να οδηγούνται στο αντίστοιχο πλαστικό σωληνάριο που περιέχει τα αρσενικά σπερματοζωάρια. Τέλος τα νεκρά σπερματοζωάρια μη φέροντας κάποιο φορτίο οδηγούνταν σε ξεχωριστό πλαστικό σωληνάριο που περιείχε τα νεκρά σπερματοζωάρια. Ως συμπέρασμα μπορούμε να αναφέρουμε ότι ο προσδιορισμός των σπερματοζωαρίων σε αρσενικά και θηλυκά μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα και στον κάπρο όπως έχει γίνει και στον ταύρο. Στους περιορισμούς Για τον προσδιορισμό των σπερματοζωαρίων του κάπρου περιλαμβάνονται κάποιοι περιορισμοί όπως είναι α) ο μεγάλος αριθμός σπερματοζωαρίων που απαιτείται όταν χρησιμοποιηθεί για την εφαρμογή της τεχνητής σπερματέγχυσης, β) η ευαισθησία των φυλοπροσδιορισμένων σπερματοζωαρίων που παρουσιάζει το σπέρμα του κάπρου σε υψηλά επίπεδα αραίωσης και κατά την κατάψυξη του και γ) ο χρόνος που απαιτείται για την παραγωγή μιας ικανοποιητικής, σε αριθμό, δόσης φυλοπροσδιορισμένων σπερματοζωαρίων για χρήση σε τεχνητή σπερματέγχυση.